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Le projet principal de la plate-forme est l’élaboration de méthodologies performantes, spécifiques et sensibles pour l’identification et la caractérisation des protéines, les peptides et autres molécules peptido-mimétiques comme certaines toxines. L’analyse des protéines dans les études protéomiques combine généralement l’électrophorèse bidimensionnelle à la détection par MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation–Time Of Flight) pour réaliser une cartographie peptidique. Ce mode d’ionisation MALDI peut être employé pour l’imagerie tissulaire via la localisation de molécules spécifiques, telles que les peptides et protéines, directement à partir de coupes de tissus ou de cellules, sains ou malades, afin de mettre en évidence la présence de marqueurs par exemple. Par ailleurs, l’émergence de techniques nano-chromatographiques liquides mono (LC-1D) ou multidimensionnelles (LC-2D) couplées à des spectromètres de masse tandem (MS/MS), comme les instruments hybrides de type QqTOF (Quadripole-Time Of Flight) ou trappe LIT-FTICR (Linear Ion Trap-Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance), sont une approche attractive par leur capacité à fragmenter des peptides présents en très faible quantité, afin d’obtenir des informations de séquence en acides aminés. Ce couplage permet dans de nombreux cas de s’affranchir de l’étape de séparation par électrophorèse bidimensionnelle et de caractériser ainsi l’ensemble des protéines ainsi que leurs modifications post-traductionnelles directement à partir de mélanges. L’ionisation en mode MALDI peut aussi être couplée à l’analyse MS/MS afin de générer des informations de séquence directement à partir de préparations ayant servi pour l’établissement de cartographies peptidiques par exemple.
Notre activité peut être articulée autour de 6 objectifs majeurs :
1.1 Évaluation des complémentarités des couplages nanoLC-MALDI MS/MS et nanoLC-ESI MS/MS pour augmenter la couverture du protéome. Nous avons observé que des conditions expérimentales identiques pour LC (même échantillon, colonne, de la pente) aboutissent à des peptides ionisés différents selon une association MALDI ou ESI, de sorte que l’ensemble du processus abouti à différentes protéines identifiées sans ambiguïté selon le mode d’ionisation utilisé (MALDI ou ESI). L’utilisation du MALDI en complément de l’ESI permet non seulement d’augmenter le nombre de protéines identifiées, mais aussi la couverture des séquences de protéines identifiées.
1.2 Analyses de routine utilisant la chromatographie liquide multidimensionnelle (MDLC) couplée à la spectrométrie de masse tandem à transformée de Fourier (en mode MS/MS) pour les peptides endogènes ou protéolytiques. Lorsque l’on travaille avec un mélange complexe de protéines, le nombre de peptides à analyser est très élevé. La combinaison d’une séparation en chromatographie en phase liquide par échange cationique (SCX) et à polarité de phase inversée (RP) est actuellement la procédure la plus courante pour la séparation des produits de protéolyse des protéines car les peptides sont séparés selon deux propriétés orthogonales (point isoélectrique et hydrophobicité). Yates et collaborateurs (Hatem et al., Journal of Chromatography, 2005) ont mis au point une technologie d’identification de protéines en ligne (MudPIT) où les phases SCX et RP sont séquentiellement conditionnées dans une seule colonne. Un avantage du MudPIT est que l’ensemble du système est couplé directement en ligne avec MS, permettant l’identification de près de 1500 protéines dans le protéome de levure et la quantification des protéines. Cependant, la séparation en ligne SCX/RP implique un compromis entre des conditions optimales pour la chromatographie sur phase SCX et sur phase RP, ce qui est délétère pour les performances de la séparation en 1ère dimension et en 2de dimension. Nous avons donc travaillé à minimiser cette limitation mais aussi à développer une alternative à ce type de couplage. Dans le cadre d’étude de peptides endogènes, le système a été couplé à un spectromètre de masse nanoESI FTICR MS/MS. A notre connaissance le couplage en ligne 2D LC FTICR MS/MS n’est pas encore disponible pour les analyses de routine en protéomique et est donc d’un intérêt majeur pour la plateforme.
1.3 Etablissement d’un protocole d’imagerie alternative en fonction des scores d’identification. La séparation des protéines en gel d’électrophorèse bidimensionnel (2DGE) a un très haut pouvoir de résolution, mais souffre de certaines limitations : visualisation des protéines mineures, gamme de masse, de pI, mauvaise solubilité des protéines hydrophobes, etc. Certaines études sont toutefois liées à l’utilisation de la cartographie par 2DGE. Ainsi en collaboration avec l’Hôpital St Antoine de Paris, nous avons entrepris une cartographie sur 2DGE des protéines exprimées par des cellules HUVECs quiescentes en culture primaire à confluence (www.huvec.com). Outre les spots non résolus et/ou trop petits qui ne pouvaient pas être découpés et analysés de façon robuste, et nous avons montré qu’un grand nombre de protéines n’étaient pas révélées après coloration au nitrate d’argent, comme le facteur von Willebrand (spécifique des ECs, stocké dans les corps Weibel-Palade). Cela souligne la nécessité d’une analyse plus poussée des séparations obtenues en 2DGE, ce que nous avons développé sur la plate-forme pour les études différentielles en protéomique fonctionnelle afin de rechercher les protéines non détectées par révélation classique des gels.
1.4 Validation d’analyse top-down LC-MS de protéines entières en utilisant la FTMS avec le développement de caractérisation structurale par IRMPD/ECD MS/MS
1.5 Validation d’approches de quantification sans marquage pour des analyses différentielles et pour le titrage absolu,
1.6 Généralisation des outils de bioinformatique pour créer une bibliothèque de spectres MS/MS de référence et pour la mise en place d’un système de gestion de l’information de laboratoire (LIMS) en vue d’un contrôle qualité labellisé. La plate-forme travaille avec de nombreux groupes différents, et il est obligatoire d’archiver les données et de stocker les informations que nous obtenons régulièrement. Cela implique également une optimisation pour éviter des tâches répétitives sans valeur ajoutée mais indispensables cependant. C’est pourquoi nous avons également commencé un projet bioinformatique 1) pour créer une bibliothèque de référence annotée de données MS/ S en utilisant un logiciel développé à l’institut Curie MyproMS ; 2) pour gérer l’ensemble des installations en termes d’échantillons, de réactifs, de données, bases de données scientifiques et rapports par adaptation d’un LIMS.
2.1 Analyse protéomique des GOM (Granular osmiophilic material) dans les pathologies de type CADASIL
(acronyme de Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy) en collaboration avec Anne Joutel Inserm U740 Faculté de médecine P7 Denis Diderot.
2.2 Identification de partenaires moléculaires des formes oligomères et fibrillaires du peptide A ?, et évaluation de la signification bio-pathologique de ces interactions.
Dans la maladie d’Alzheimer le peptide amyloide bêta (A ?) est surexprimé et se lie à une grande variété de molécules, en induisant une synapto-toxicité et une neurotoxicité. La conversion de l’A ? d’une forme soluble en une forme fibrillaire augmente sa capacité de liaison aux lipides et protéines membranaires. L’objectif de ce projet est d’identifier par spectrométrie de masse les partenaires protéiques des différentes formes de l’A ? et de caractériser son environnement lipidique avant de s’intéresser à la signification biologique de ces interactions sur des extraits de neuroblastomes humains en culture, avant de passer à l’étude de ces protéines dans le cerveau.
2.3 Etude de l’état oxidatif des protéines
L’importance biologique de l’étude de l’état oxydatif des protéines nécessite le développement de nouvelles approches permettant d’évaluer l’état d’oxydation des protéines et de suivre la variation de cet état en fonction de différents événements cellulaires. L’utilisation de dérivés du dansyl pour le marquage des cystéines des protéines a été réalisée. Les résultats obtenus ont montré que le dansyl peut permettre de déterminer les variations d’état d’oxydation des cystéines par des techniques de cytométrie de flux, d’électrophorèse 2D et de spectrométrie de masse.
2.4 Identification des acteurs de la cascade de réponse immunitaire Imd (en collaboration avec l’IBMC de Strasbourg).
La réponse immunitaire contre des agents pathogènes fait l’objet de recherches intensives, en particulier chez la drosophile. Les travaux menés dans ce domaine, basés sur des analyses génétiques, ont permi de démontrer que deux cascades de signalisation intracellulaires sont impliquées dans la réponse anti-microbiale : (1) la voie Toll qui es activée suite aux infections par des champignons et des bactéries Gram-positives, et (2) la voie Imd en réponse aux infections Gram-négatives. Cette voie Imd présente d’importantes similarités avec la voie TNF des mammifères. Les études génétiques ont permi d’identifier une douzaine de protéines dans cette voie. Afin de déterminer comment ces protéines interagissent, l’IBMC de Strasbourg a développée une approche protéomique, dont nous réalisons l’identification des protéines.